●冻存管细胞处理方式（复苏）

1、操作前需将生物安全柜紫外照射30 min，并确认水浴锅清洁且升温至37℃。

2、将含有1mL细胞悬液的冻存管在37 ℃水浴锅中迅速摇晃解冻（尽量在1-2 min内融化），加入到含有9 ml已预热完全培养基的离心管中轻柔吹打混匀。

3、离心机1000 rpm离心3 min，弃上清，取1ml完全培养基轻柔吹打重悬细胞。

4、将细胞悬液加入含有4 ml完全培养基的T25瓶中，混匀后放置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养（如有特殊需求的细胞根据细胞说明书具体培养条件培养）。

5、细胞达到传代密度后进行传代，传代参考复苏瓶细胞处理方式中的传代步骤。

●复苏瓶细胞处理方式（处理及传代）

（一）到货后处理

1、 收到复苏瓶细胞后，用75%酒精擦拭细胞培养瓶表面，显微镜下观察细胞状态。将细胞置于细胞培养箱内静置培养2~4小时，以便稳定细胞状态。

2、 仔细阅读细胞说明书了解细胞相关信息，静置完成后，取出细胞培养瓶，镜检、拍照，记录细胞状态。

3、 若细胞生长密度超过80%，可正常传代，首次传代推荐 1:2~1:3；未超过 80%，移除细胞培养瓶内培养基，预留6mL 左右原瓶培养基继续培养，直至细胞密度达 80%左右再进行传代操作，注意拧松瓶盖或更换透气瓶盖。

（二）传代（贴壁细胞参考）

1、弃去培养基，用2-3 ml PBS润洗细胞1-2次。

2、吸弃PBS，在T25瓶（10 cm皿）中加入1-2 ml 0.25 % 胰蛋白酶（含EDTA），轻轻晃动使其铺匀瓶底（皿底）。

3、放入37 ℃培养箱消化1-2 min（难消化的细胞可以适当延长消化时间）， 显微镜下观察到细胞变圆或呈流沙状移动但未完全脱落时加2-3 ml完全培养基终止消化，轻柔吹打成均匀的细胞悬液。

4、细胞悬液离心机1000 rpm离心3 min，弃上清，加入新的完全培养基轻柔吹打重悬细胞。

5、根据细胞说明书及细胞具体状态按比例将细胞悬液分配到新的含有完全培养基的培养瓶（皿）中。

6、细胞悬液混匀后将培养瓶（皿）放置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养（如有特殊需求的细胞根据细胞说明书具体培养条件培养）。

●注意事项

1、请在无菌环境中操作，避免污染。

2、运输的培养基不能用来再培养细胞，请按照说明配制培养基进行细胞培养。

3、所有动物细胞均视为有潜在生物危害性，处理时需在二级生物安全柜中完成实验操作。

4、建议复苏冻存细胞时使用防护手套、衣服及防护面罩避免解冻时出现容器爆炸及盖子弹开造成人员伤害。